Antidotal and Neuroprotective Efficacies of a Prophylactic Patch against Sarin and Soman Poisonings in Guinea Pigs

Youngjo Song

doi:10.9766/KIMST.2021.24.1.144

Abstract

This study was designed to evaluate the prophylactic efficacy of a combinational patch system containing physostigmine and procyclidine against sarin and soman using guinea pig. The median lethal dose values of two nerve agents were calculated by a probit analysis of deaths occurring within 24 h. In this study, the values of median lethal dose of sarin and soman were determined to be 33.0 and 26.7 μg/kg in guinea-pigs, respectively. The guinea pigs treated with a prophylactic patch(4×5 cm²) for 24 h were 100 % protected against a challenge of 1.5 LD₅₀. The combinational KMARK-1(atropine and 2-PAM) and prophylactic patch were more effective than a single KMARK-1, a combination of pyridostigmine and KMARK-1 significantly. Epileptiform seizures in the guinea pigs treated with the combinational antidotes led to neuropathological changes, in comparison with intact feature of brain of the animal treated with the patch.

Keywords: 기니픽, 예방패치, 반수치사량, 뇌보호, 소만, 사린

Keywords: Guinea Pig, Prophylactic Patch, LD₅₀, Neuroprotection, Soman, Sarin

서 론

신경작용제는 조직에서 Acetylcholinesterase(AChE)를 비가역적으로 저해하여 과 분비, 근섬유다발수축, 진전, 경련, 호흡곤란, 간질 발작과 같은 중독 증상을 일으키고 뇌손상 및 사망에 이르게 한다^[1,2]. 신경작용제 중독에 대한 치료로 atropine과 같은 콜린성 약물은 무스카린 수용체를 차단하여 AChE의 억제로 인해 상승된 ACh의 효과를 길항하기 위해 투여되고, pyridine-2-aldoxim methylchloride(2-PAM)과 같은 oxime은 정상적인 AChE 활성을 회복시키기 위해 투여된다^[3–5]. 그러나 AChE와 결합된 신경작용제는 탈 알킬화 후에 더 이상 oxime에 의해 효소로부터 제거될 수 없다. 따라서 수분 이내에 aging이 일어나는 soman에 중독된 경우 oxime과 atropine 만으로는 치료가 어렵다. 따라서 가역적으로 AChE의 효소활성을 억제하여 일정부분의 AChE의 활성부위를 신경작용제가 결합할 수 없도록 만들어 결과적으로 신경작용제 공격으로부터 보호하는 pyridostigmine을 전처치제로 사용한다. 그러나 이 약물들로만은 신경작용제에 의해 유발되는 seizure를 막아줄 수 없으므로 생존하더라도 치명적인 뇌 손상을 초래하게 된다^[6,7]. 중추신경계에 대한 약효를 기대할 수 없는 pyridostigmine의 대체약물로 지목된 physostigmine 은 혈액 속에서 반감기가 짧고 유효 약물농도 범위가 좁지만 항콜린성 약물을 복합 투여하면 독성은 서로 상쇄되고 약효는 상승되는 매우 이상적인 연구들이 다수 보고되어있다^[8,9]. 이러한 연구결과들을 바탕으로 신경작용제에 대한 NMDA 길항 및 항콜린효과를 지닌 procyclidine과 physostigmine을 주성분으로 하는 복합제 패치를 개발하였다. 본 연구에서는 기니픽을 이용하여 신경작용제 예방패치의 예방방어, 해독촉진, 뇌 보호 효과를 평가하였다.

재료 및 방법

2.1 시험물질

2.1.1 신경작용제

본 연구에서는 국방과학연구소에서 직접 합성하여 순도 97 %로 확인된 sarin 및 soman을 사용하였다.

2.1.2 예방패치 성분

본 연구에서는 삼양화학기술연구소로부터 제공받은 신경작용제 예방패치를 4×5 cm² 크기로 절단하여 사용하였으며 4×5 cm² 크기 기준 예방패치의 성분은 physostigmine 3.6 mg과 procyclidine 14.2 mg이다.

2.1.3 해독제

본 연구에서는 현재 미국에서 전처치제로 사용되고 있는 pyridostigmine을 예방패치와 비교하기 위하여 pyridostigmine(Sigma Aldrich, MO, USA) 0.026 μg/kg 용량으로 사용하였고, 현재 군에서 보유하고 있는 해독 제인 KMARK-1과 의 병용투여 효과를 확인하기 위하여 atropine sulfate(Sigma Aldrich, MO, USA)와 2-PAM (Sigma Aldrich, MO, USA)을 각각 2 mg/kg, 25 mg/kg 용량으로 사용하였다.

2.2 동물

일본으로부터 수입한 5주령 수컷 기니픽(Guinea Pig; Hartley, SPF)을 사용하였다. 동물 실험은 국방과학연구소 동물실험윤리위원회의 승인을 받고 수행하였다(ADD-IACUC-15-20, ADD-IACUC-16-18, ADD-IACUC-16-19).

2.3 Sarin 및 soman 반수치사량 산정

본 연구에서는 예방패치의 예방방어, 해독촉진, 뇌 보호 평가를 위해 기니픽을 이용하여 반수치사량 산정시험을 실시하였다. Sarin과 soman에 대한 반수치사량 산정시험을 실시하기 위하여 참고문헌에서의 sarin과 soman의 반수치사량(sarin: 42 μg/kg, soman: 28 μg/kg)을 참고하여 각각 20∼60 μg/kg, 7.5∼30 μg/kg 용량을 기니픽에 피하투여하였다^[7]. 작용제 투여 24 h 후 폐사를 확인하였고 probit analysis법을 이용하여 반수치사량을 산정하였다.

2.4 예방패치의 예방 방어 효능평가

반수치사량 산정시험 결과를 바탕으로 예방패치의 예방 방어 효능을 수행하였다. 기니픽의 등 부위를 제모하고 예방패치를 부착한 후 테이핑을 하여 패치가 손상되지 않도록 하였다. 시험은 총 4그룹으로 그룹별 5마리의 기니픽을 무작위로 배치하였다. 그룹 1–2는 4×5 cm² 크기의 예방패치를 24 h 부착 후 sarin 및 soman을 1.5 LD₅₀ 용량으로 공격하였고, 그룹 3–4는 대조군으로 패치를 부착하지 않고 sarin 및 soman을 1.5 LD₅₀ 용량으로 공격하였으며 임상 증상 및 24 h 후 폐사율을 확인하였다.

2.5 예방패치의 해독 촉진효과 평가

Sarin과 soman에 대한 신경작용제 예방패치와 KMARK-1의 병용투여에 대한 효과를 확인하기 위하여 총 6개의 그룹을 구성하여 시험을 수행하였다. 각 그룹은 5–7마리의 기니픽이 무작위로 배치되었다. 그룹 1과 그룹 4는 예방패치를 부착하고 24시간 뒤 sarin과 soman 5.0 LD₅₀을 각각 투여하고 1분 후 KMARK-1을 투여하였다. 그룹 2와 그룹 5는 pyridostigmine을 근육 투여하고 30분 후 sarin과 soman 5.0 LD₅₀을 각각 투여하고 1분 후 KMARK-1을 근육 투여하였다. 또한 그룹 3과 그룹 6은 대조군으로 전처치 없이 sarin과 soman 5.0 LD₅₀을 각각 투여하고 1분 후 KMARK-1을 투여하여 생존율을 확인하였다.

2.6 아세틸콜린에스터라제 효소활성의 억제 평가

아세틸콜린에스터라제 활성을 분석하여 약물에 의한 억제율을 평가하였다. 패치 부착 전 채혈한 혈액과 작용제 투여 후 채혈한 혈액을 이용하여 기존에 보고된 시험법^[8]을 참고하여 분석하였다.

2.7 예방패치의 뇌보호 효과 평가

신경작용제 예방패치의 뇌 보호 효과를 확인하기 위하여 5개의 그룹을 구성하여 시험을 수행하였다. 각 그룹은 5마리의 기니픽이 무작위로 배치되었다. 그룹 1은 정상 기니픽 군으로 전 처치, 후 처치, 작용제 투여가 없는 그룹이고 그룹 2는 대조군으로 sarin 1.5–2.0 LD₅₀만 투여해야 하지만 sarin을 투여한 그룹은 24시간까지 생존할 수 없기 때문에 생존을 위하여 atropine 과 2-PAM을 투여하였다. 그럼에도 불구하고 폐사하는 경우가 많아서 생존 개체가 5마리 이상이 될 때까지 반복실험하였다. 그룹 3은 예방패치를 부착하고 24 h 뒤 sarin 2.0 LD₅₀을 투여하였다. 그룹 4는 전 처치 없이 soman 1.5 LD₅₀을 투여하고 그룹 2와 마찬가지로 atropine과 2-PAM을 투여하였고 생존 개체가 5마리 이상이 될 때까지 추가 실험하였다. 그룹 5는 예방패치를 24 h 부착한 후 soman 2.0 LD₅₀을 투여하였다. 그룹 6은 pyridostigmine을 전처치하고 soman 1.5 LD₅₀을 투여한 후 atropine과 2PAM을 투여하였다. 작용제 투여 5 h∼1주일 후 관류 고정하였고 뇌 조직 슬라이드를 제작하여 뇌 보호 효과를 확인하였다.

2.7.1 병리조직 평가

뇌보호 효과는 신경작용제 중독 후 가장 심하게 손상을 받는 (1) cerebral cortex, (2) hippocampus, (3) thalamus, (4) cortical amygdala, (5) pyriform cortex에서의 신경작용제 예방패치 처치 유무에 따른 뇌세포 괴사 및 주위 뇌조직의 변성 정도를 지표로 평가하였다^[4]. 통계학적 분석은 상용으로 사용되는 SPSS statistics 프로그램을 이용하였고 유의수준은 P<0.05로 설정하였으며 Mann-Whitney U-test를 통해 대조군과의 유의성을 확인하였다(Table 1).

Table 1.

Scoring of brain histopathology

점수	뇌조직의 변성 정도
0점	정상소견
1점	미미함(뇌세포 사망 및 조직손상 범위가 1∼10 %)
2점	약함(뇌세포 사망 및 조직손상 범위가 11∼25 %)
3점	중등도(뇌세포 사망 및 조직손상 범위가 26∼45 %)
4점	심함(뇌세포 사망 및 조직손상 범위가 46∼60 %)
5점	극히 심함(뇌세포 사망 및 조직손상 범위가 60 % 이상)

결 과

3.1 Sarin 반수치사량 산정 결과

Sarin에 대한 기니픽 반수치사량 산정시험 결과는 Table 2와 같이 나타났고 probit analysis에 의해 33.04 μg/kg으로 산정되었다.

Table 2.

Animal responses against sarin

그룹	투여 용량 (μg/kg)	폐사개체/전체개체	투여경로	관찰 및판정
G1	60	5/5	피하	작용제 투여24시간 후기준
G2	40	15/15
G3	35	3/5
G4	30	1/5
G5	20	0/5

3.2 Soman 반수치사량 산정 결과

Soman에 대한 기니픽 반수치사량 산정시험 결과는 Table 3과 같이 나타났고 probit analysis에 의해 26.696 μg/kg으로 산정되었다.

Table 3.

Animal responses against soman

그룹	투여 용량(μg/kg)	폐사개체/전체개체	투여경로	관찰 및판정
G1	30	14/15	피하	작용제 투여24시간 후확인
G2	25	1/5
G3	20	0/10
G4	15	0/10
G5	10	0/5
G6	7.5	0/5

3.3 예방패치 방어 효능 결과

예방패치의 방어 효능평가 시험결과 sarin과 soman 1.5 LD₅₀에 대해 100% 방어하였다(Fig. 1).

Fig. 1.

Efficacy of patch against sarin and soman

3.4 예방패치 해독촉진 효과 평가 결과

예방패치의 해독촉진 효과 평가결과 sarin 5.0 LD₅₀에 대해 패치와 atropine + 2-PAM을 함께 처치한 그룹은 100 %(5/5) 생존하였고, pyridostigmine과 atropine + 2-PAM을 함께 처치한 그룹은 60 %(3/5)의 생존율을 보였으며 atropine + 2-PAM만 투여한 대조군은 14.7 %(1/7) 생존하였다(Fig. 2).

Fig. 2.

The combinational effects of the prophylactic patch and therapeutic antidotes against sarin

또한, soman 5.0LD₅₀에 대해 패치와 atropine + 2-PAM을 함께 처치한 그룹은 80 %(4/5) 생존하였고, pyridostigmine과 atropine + 2-PAM을 함께 처치한 그룹은 20 %(1/5)의 생존율을 보였으며 atropine + 2-PAM 만 투여한 대조군은 모두 폐사하여 0 %(0/5)의 생존율 을 보였다(Fig. 3).

Fig. 3.

The combinational effects of the prophylactic patch and therapeutic antidotes against soman

3.5 아세틸콜린에스터라제 효소활성 측정 결과

기니픽에게 4×5 cm² 크기의 예방패치 부착 시 최대효소억제율은 평균 69.6 %로 6 h 후에 나타났고, 72 h 에서의 효소억제율은 평균 26.9 %로 확인되어 패치 부착 군에서 6∼72 h에서 모두 20 % 이상의 효소억제율을 보였다. 예방패치를 24 h 동안 부착한 후 soman (GD)을 피하 투여하였을 때 1 h 후에는 효소억제율이 평균 80.9 %까지 급증하였고 2시간 후 평균 83.9 %까지 효소억제율이 올라갔다가 이후 패치 부착기준 48 h까지 75.5 % 효소가 억제된 상태를 유지하였다(Fig. 4, 5).

Fig. 4.

Inhibition rate of blood ChE activity during 3-day attachment with a patch(4×5 cm²)

Fig. 5.

Inhibition rate of blood ChE activity after soman challenge

3.6 예방패치 뇌 보호 효과 결과

신경작용제 예방패치의 뇌 보호 효과를 확인하기 위하여 신경작용제 sarin을 처치한 G2, G3의 뇌의 각 관찰부위별 뇌 손상 정도를 평가한 결과, 평균값±표준오차 값은 Table 4와 같았다. 군간 총합(sum)에 대한 비교평가 시 예방패치를 부착한 G3의 뇌 손상(brain damage) 점수(0.8±0.4)는 KMARK-1을 투여한 대조군 G2군의 뇌손상 점수(11.4±0.9)보다 통계학적으로 유의적으로 낮았다(P<0.05). 신경작용제 soman를 처치한 G4, G5, G6군의 뇌의 각 관찰부위별 뇌 손상 정도를 평가한 결과 평균값±표준오차 값은 Table 4와 같았다. 예방패치를 부착한 시험군(G5)에서 뇌손상 정도가 가장 적었으며, 그 다음으로 atropine + 2-PAM을 후처치한 시험군(G4)이, pyridostigmine을 전처치하고 atropine + 2PAM을 후처치한 시험군(G6)보다 뇌손상 정도가 미약하게 상대적으로 적었다. 군간 총합(sum)에 대한 비교평가 시 G5의 등급(0.2±0.2)은 G4의 등급(13.0±1.2)과 G6의 등급(17.3±0.3)에 대하여 통계학적으로 유의적인 차이를 보였다(P<0.05). 병리조직 검경 시 패치를 부착한 군에서는 세포 손상이 현저히 감소하는 것을 확인하였다(Fig. 6, 7).

Table 4.

Results of brain histopathology

그 룹	기니픽 뇌(부위별)
그 룹	Cerebral cortex	Hippo-campus	Thala mus	Cortical amygdala	Pyriform cortex	Sum
G1	0.0±0.0	0.4±0.2	0.0±0.0	0.0±0.0	0.2±0.2	0.6±0.2
G2	4.0±0.0	1.4±0.2	2.0±0.0	1.8±0.5	2.2±0.4	11.4±0.9
G3	0.2±0.2	0.0±0.0	0.4±0.2	0.2±0.2	0.0±0.0	0.8±0.4*
G4	3.2±0.5	3.4±0.4	1.8±0.2	2.8±0.2	1.8±0.5	13.0±1.2
G5	0.2±0.2	0.0±0.0	0.0±0.0	0.0±0.0	0.0±0.0	0.2±0.2#†
G6	4.0±0.0	4.3±0.7	2.3±0.3	3.7±0.3	3.0±0.0	17.3±0.3

G1; Normal, G2; Atropine + 2-PAM against Sarin 1.5–2.0 LD₅₀, G3; Patch against Sarin 2.0 LD₅₀, G4; Atropine + 2-PAM against Soman 1.5 LD₅₀, G5; Patch against Soman 2.0 LD₅₀. Data are expressed as Mean ± S.E.M., the symbol * represents statistical significance of P values less than 0.05, with respect to G2 group. The symbol † and # represent statistical significance of P values less than 0.05, with respect to G4 and G6 group, respectively.

Fig. 6.

Brain histopathology A. Cerebral cortex of patch group. B. Cerebral cortex of control group(red arrow: neuronal necrosis, green arrow: neuronal vacuolation)

Fig. 7.

Brain histopathology A. Hippocampus of patch group. B. Hippocampus of control group(red arrow: neuronal necrosis, green arrow: neuronal vacuolation)

결 론

Carbamate의 전처치가 발작과 뇌 손상을 감소시킨다고 보고되어있었기 때문에 우리 팀은 carbamate 중 하나인 physostigmine을 포함하는 예방제 개발을 위한 연구들을 해왔다. Physostigmine과 procyclidine을 신경작용제 soman을 투여하기 전 피하투여하여 랫과 기니픽에서 효능을 확인하였고^[10], physostigmine과 procyclidine 을 포함하는 osmotic minipump를 이용하여 랫에서 신경작용제 soman에 대한 효능이 있는 것을 확인하였으며^[11] physostigmine과 procyclidine을 포함하는 예방패치가 개에서 신경작용제 soman 중독을 예방하는 효능이 있는 것을 확인하였다^[12]. 본 연구에서는 procyclidine 과 physostigmine을 주성분으로 하는 복합제 패치인 신경작용제 예방패치의 예방방어효능을 기니픽을 이용하여 평가하였다. 연구를 진행하기 위하여 Probit 법을 이용해 기니픽에서 sarin과 soman에 대한 반수치사량을 산정하였다. 신경작용제 sarin의 반수치사량은 33.042 μg/kg (29.033 ∼ 35.533 μg/kg), soman의 반수치사량은 26.696 μg/kg (23.323 ∼ 28.360 μg/kg)으로 산정되었다. Sarin의 경우에는 기존에 보고되어 있던 반수치사량(42 μg/kg) 보다 낮게 산정되었고, soman의 경우에는 기존에 보고되어 있던 반수치사량(28 μg/kg)과 비슷하게 산정되었다^[7].

패치에 대한 예방방어율을 평가한 결과 sarin 1.5 LD₅₀에 대해 100 % 방어하였고 soman 1.5 LD₅₀에 대해 100 % 방어하였다. 해독 촉진 효과에서는 KMARK-1 단독으로 투여했을 때보다 패치와 KMARK-1을 병용으로 사용 시 방어능이 유의적으로 상승하는 결과를 확인할 수 있었다.

패치 부착 후 아세틸콜린에스터라제 억제율을 평가한 결과 6시간째 최고 억제율을 보이고 24시간 째에는 평균 40–50 %을 억제율을 보였다. 또한 72시간까지도 20–30 % 억제율이 관찰되어 6∼72시간 사이에는 모두 20 % 이상의 효소억제율이 관찰되었다. 신경작용제 투여 후 가장 심하게 손상을 받을 것으로 예상되는 뇌의 cerebral cortex, hippocampus, thalamus, cortical amygdala 및 pyriform cortex에서 신경작용제 예방패치 처치 유무에 따른 뇌 손상 정도를 평가하기 위해 수행되었다. 본 시험 여건 하에서, 양성대조군 대비 예방패치군의 뇌손상 정도가 통계학적 유의성을 보이며 감소하는 것으로 확인되었다. 따라서 physostigmine과 procyclidine 을 포함하는 예방패치는 기존연구에서 수행한 beagle dog에서의 효능평가 결과와 마찬가지로 신경작용제 sarin과 soman 중독에 대한 예방, 해독 및 뇌 보호 효능이 있는 것으로 판단된다^[12].